Pauley Perrette se jako dítě mnohokrát stěhovala kvůli zaměstnání jejího otce. Studovala kriminalistiku na Georgijské státní univerzitě v Atlantě. Později se přestěhovala do New Yorku, aby se mohla věnovat herectví. Vyzkoušela mnoho zaměstnání (např. barmanky, kadeřnice nebo fotografky). Nakonec začala natáčet videoklipy a reklamy a to ji přivedlo ke skutečným filmovým rolím.

Hrála v seriálu Vražda prvního stupně (Murder one). Objevila se v Show Drewa Careyho, v seriálu Jesse, dále hostovala v Frasierových, Early Edition a Moloney. Z jejích filmů lze zmínit Romy and Michelle's High School Reunion, The Cowboy Way nebo nezávislý snímek The Price of Kissing and Angel. Její dosud největší rolí je postava Abby Sciuto, soudní znalkyně v seriálu NCIS: Námořní vyšetřovací služba.

Pauley je také zpěvačka. Dříve hrála se svou kapelou Lo-Ball. Jejich nejspíš nejznámnější písničkou je song, který se objevil ve filmu Pravá blondýnka - Can't get me down.